清洁液的配制:取重铬酸钾10克,溶于63毫升常温清水中,配成重铬酸钾饱和溶液。再吸取此溶液35毫升,加入粗质浓硫酸1000毫升中即成。
三、细菌涂片的制备及染色
1.细菌涂片的制备
(1)玻片准备:载玻片应该清洁、透明而无油渍,滴上水后,能均匀展开。如有残余油渍,可按下列方法处理:①滴上95%酒精2~3滴,用洁净纱布擦拭,然后在在酒精灯火焰上轻轻通过几次。②若上法仍未能去除油渍,可再滴上1~2滴冰醋酸,再在酒精灯火焰上轻轻通过。
(2)涂片:①液体材料(如液体培养物、血液、渗出液),可直接用灭菌接种环取一环材料,置于玻片中央,均匀地涂布成适当大小的薄层。②固体材料(如菌落、脓、粪便等),则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水,置于玻片中央,然后再用来菌接种环取少量液体,在液体中混合,均匀涂布成适当大小的薄层。③组织脏器材料,先用镊子夹住局部,然后用灭菌的剪刀取1小块,夹出后将其新鲜切面在玻片上压印或涂抹成一薄层。如有多个样品同时需要制成涂片,只要染色方法相同,也可以在同一张玻片上,先用蜡笔划分成若干小方格,每方格涂抹一种样品。需要保留的标本片,应贴标签,注明菌名、材料、染色方法和制片日期等。
(3)干燥:上述涂片,均应让其自然干燥。
(4)固定:有火焰和化学两种固定方法。
①火焰固定:将干燥好的涂片涂面向上,以其背面在酒精灯上来回通过数次,略作加热固定。
②化学固定:干燥涂片用甲醇固定。
2.染色
(1)革兰氏染色:①将已干燥的涂片用火焰固定。②在固定好的涂片上,滴加草酸铵结晶紫染色液,经1~2分钟,水洗。③加革兰氏碘溶液于涂片上媒染,作用1~3分钟,水洗。④加95%酒精于涂片上脱色,约30秒钟,水洗。⑤加稀释石炭酸复红(或沙黄水溶液)复染10~30秒钟,水洗。⑥吸干或自然干燥,镜检可见:革兰氏阳性菌呈蓝紫色,革兰氏阴性菌呈红色。
(2)瑞氏染色法:涂片自然干燥后,滴加瑞氏染色液,为了避免很快变干,染色液可稍多加些,或者看情况补充滴加。经1~3分钟再加约与染色液等量的中性蒸馏水或缓冲液,轻轻晃动玻片,使与染液混匀。约经5分钟左右,直接用水冲洗(不可先将染液倾去),吸干或烘干,镜检可见:细菌为蓝色,组织、细胞等物呈其他颜色。
(3)染色液的制备:
①革兰氏染色液的配制:
结晶紫染液:甲液:结晶紫2克,95%酒精20毫升;乙液:草酸铵0.8克,蒸馏水80毫升。
先将甲液稀释5倍,加20毫升,再加乙液80毫升,混合即成。此液可较久储存。革兰氏碘溶液:碘片1克,碘化钾2克,蒸馏水300毫升。
先将碘化钾加入3~5毫升的蒸馏水中溶解后再加碘片,用力摇匀,使碘片完全溶解后再加蒸馏水至足量(直接将碘片与碘化钾加入蒸馏水中,则碘片不能溶解)。革兰氏碘溶液不能久藏,1次不宜配制过多。
复染剂:番红(沙黄)复染液:2.5%番红纯酒精溶液10毫升,蒸馏水90毫升,混合即成。碱性复红复染液:碱性复红0.1克,蒸馏水100毫升。
②瑞氏染色液的配制:瑞氏染色剂粉0.1克,纯粹白甘油1毫升,中性甲醇60毫升。
置染料于一干净的乳钵内,加甘油后研磨至细末,再加入甲醇使其溶解。溶解后盛于棕色瓶中,经1周后,过滤,装于中性的的棕色瓶中,保存暗处。该染色剂保存时间愈久,染色的色泽愈鲜。
四、病毒的鸡胚培养
许多病毒均能在鸡胚上发育繁殖。因此,利用鸡胚培养病毒就成为病毒学上的一种常用的方法,用它可以分离、鉴定某些病毒,制备一些抗原,生产一部分疫苗。
(一)材料与设备
(1)常选用健康白色鸡的受精蛋,通常用产后10天之内的新鲜鸡蛋。
(2)孵化器可购置1具小型孵化器。
(3)检蛋蛋灯及暗室检蛋灯分固定及手持式两种。
①固定式检蛋灯:为一方形木盒,在底部或一侧装100W灯泡1个。上盖开一蛋形孔,周围包以棉布或胶皮,使之适于放置鸡蛋而不露光,在暗室中即可检蛋或定胎位。如无暗室,用黑布覆盖检查者的头部及木盒,也能检蛋。
②手持式检蛋灯:为一有柄圆形筒,内装60W灯泡1个,筒端口缘包以胶皮,柄上附开关,在暗室中持灯将筒口罩于竖立蛋上,即可观察胚胎发育状况,使用方便。
(4)开蛋器市上买的钢锥或兽用采血针头,均可用来钻孔。牙科磨牙机或电烙器,可用于开蛋窗。
(5)蛋盘及蛋座蛋盘为盒形木制,在上层板上开略小于鸡蛋的圆形或椭圆形孔数行,圆形孔可竖立放置待检蛋,椭圆形孔可横卧放置待检蛋。定胎位后,接种、解剖及固定培养时,使用此盘。
蛋座为小方形木盒,上有圆形或椭圆形孔1个,供接种或解剖收获时用。
(6)接种罩及紫外线灯接种或收获时,为了避免污染及传染,必须在接种罩中操作。罩内装置紫外线灯,以便消毒。
除上述材料与设备外,还需1~5毫升注射器、胶皮乳头、无菌滴管、玻璃纸或电工用透明胶纸、病毒保存液(缓冲甘油液或50%兔血清缓冲盐水)、灭菌培养皿、乳钵、玻璃研磨器、镊子、剪子以及各种消毒液(3%碘酊、酒精棉球、3%来苏儿)等。
(二)操作技术
1.鸡胚的孵化及检蛋
将选好的鸡蛋,先用温水洗净,并用酒精纱布擦拭后,放入37.5~38℃,湿度为45%~60%的孵蛋箱内,每日孵蛋2~3次。孵后第四天开始用检蛋灯照视发育情况,若仅见模糊的蛋黄黑影,无鸡胚迹象,则为未受精蛋;4日后若见清晰血管小团,其中有鸡胚暗影,较大的鸡胚则可见到胚动,则为活鸡胚;鸡胚活动呆滞或不能主动运动,血管昏暗或断折沉落,则为濒死或死亡鸡胚。
2.鸡胚的接种法
包括卵黄囊接种法、绒毛尿囊膜接种法、尿囊接种法、囊膜接种法、静脉接种法、脑内接种法等。现将绒毛尿囊膜接种法及尿囊接种法介绍如下:



