摘要： 将中药方1、方2、和方3的粗提物与鸡传染性法氏囊 病 毒以三种顺序(先加中药后加病毒、先加病毒后加中药、中药和病毒同时加入)加入到培养24 h、已长成完整单层的鸡胚成纤维细胞(CEF)上，观察它们对病毒感染细胞能力的影响。结 果表明:在细胞安全浓度范围内,方1、方2和方3的粗提物在先于病毒或与病毒同时加入时 均能抑制病毒感染,且与浓度和加药方式有关；以补气、清热凉血、滋阴为主的方3优于以补 气、清热凉血为主的方1和以补气为主的方2。
关键词: 中药方剂粗提物; IBDV; CEF; 感染细胞能力
鸡传染性法氏囊病是由鸡传染性法氏囊病毒感染引起的、危害 雏鸡的急性、高度接触性传染病。因其发病急、传播迅速、死亡率高，给养鸡 业带来巨大损失。近年来，关于中药治疗IBD的报道不少，但通过细胞培养的方 法筛选抗IBDV主药及其复方尚未见报道。本研究在用细胞培养的方法测定了数种中药粗提物 对IBDV感染细胞能力的基础上,以黄芪为主药,佐以板蓝根、大青叶和生地等组 成以补气、清热凉血为主的方1、以补气为主的方2和以补气、清热凉血、滋阴为主的方3,进 一步用细胞培养的方法测定并比较了三种方剂粗提物对IBDV感染细胞能力的影响,从而 为研制抗鸡传染性法氏囊病的中药制剂提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 中药方剂粗提物制备 取黄芪、板蓝根、生地等中药(购自南京医药公司)，按一定比例分别组成方1、 方2和方3,分别煎煮3次,合并煎液并浓缩至1 g/ml,离心,取上清,4 ℃保存。根据安全浓度测 定结果,分别稀释成以下浓度(mg/ml):方1,0.7813;方2,25.000;方3,0.7813。临用前在24孔细胞培养板上用细胞维持液倍比稀释至11孔。
1.2 病毒准备 取鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)中等毒力活疫苗(中牧股份南京药械厂生产,批 号295-1)以细胞维持液10倍系列稀释,用Reed—Mueeh法测得半数组织培养感染 剂量(TCID-50)为1×10－7,临用前稀释成1×10－5(100TCID-50 )。
1.3 试剂配制 MEM细胞培养液:取MEM(日水制药株式会社产品)9.4 g,加双蒸水1 000 ml,溶 解,分装,121 ℃高压灭菌15 min,4 ℃保存。临用前取100 ml, 用10％ NaHCO3 调pH 7.2～7.4,加入5 ml犊牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司生产)和1 ml 3％L-谷胺 酰氨 即为细胞生长液;不加犊牛血清则为细胞维持液。0.25％和0.025％胰蛋白酶溶液:取胰蛋 白酶(GIBCO公司产品)0.25 g和0.025 g,分别加入CMF-PBS液100 ml,溶解,加入1%酚红,0. 22 μm微孔滤膜过滤,用10％NaHCO3 调pH至7.2～7.4,分装,-20 ℃冷冻保存备用。3％L-谷胺酰氨:取L-谷胺酰氨(上海康达氨基酸厂出品)3.0 g,加入CMF-PBS液100 ml,溶 解,配成3％L-谷胺酰氨溶液，细菌过滤器过滤,分装,-20 ℃冷冻保存备用。
1.4 仪器和材料 CO2培养箱,24孔、96孔细胞培养板,细胞培养瓶，高速离心机等。
1.5. 实验方法 取9日龄SPF鸡胚(由中牧股份南京药械厂提供)去头、爪和内脏,用D-Hanks液冲 洗3次后置于小烧杯中,剪成1 mm3 左右大小的碎块,再用D-Hanks液冲洗3次,然后加入4倍 量的0.25％胰蛋白酶液,轻轻摇匀后置于37 ℃水浴中消化至组织块变得疏松、表面发毛;弃 上层胰酶,用D-Hanks液冲洗,吹散,纱布过滤,以MEM细胞生长液调整细胞数至约1×106个/ ml,分装100 ml细胞瓶(10 ml/瓶),置5％ CO2 培养箱中37 ℃培养24 h,待细胞长成致密单 层,再用0.025％胰酶消化,洗去胰酶,每瓶用细胞生长液稀释成10 ml,转入96孔细胞板,每孔 0.2 ml,继续培养,待细胞长成完整单层时,小心吸去细胞生长液,按以下三种顺序加入中药 和病毒。
1.5.1 先加中药后加病毒 取各稀释度中药分别加入到CEF单层 中,每个浓度重复4孔,每孔0.1 ml,置5％ CO2培养箱中37 ℃培养24 h后,各孔再加入0.1 ml 的病毒液,每个稀释度同时设中药对照(只加中药0.2 ml)、病毒对照(只加0.2 ml病毒 )和细胞对照(只加0.2 ml细胞维持液)继续培养,每隔24 h在倒置显微镜下观察,直至病毒对 照组细胞完全死亡时。
1.5.2 先加病毒后加中药 先将病毒液加入CEF单 层中,每孔0.1 ml,培养24 h后,加入各稀释度中药,每孔0.1 ml,每个稀释度重复4孔;同时 设中药对照、病毒对照和细胞对照。观察同1.5.1项。
1.5.3 病毒和中药同时加入 将各稀释度中药加入CEF单层中, 每个浓度重复6孔,每孔0.1 ml;同时加入病毒液,每孔0.1 ml。并设中药对照、病毒对照和 细胞对照。观察同1.5.1项。
1.6 结果判定 按以下标准判定和记录: -:细胞全部死亡或仅有少数活细胞,表示中药不能抑制病毒;＋:活细胞较多,细胞单层出现严重拉网状,表示弱抑制;++:细胞单层完好,折光性差,表示中抑制; +++:细胞单层完好,折光性好,表示强抑制。
2 结果
2.1 方1粗提物对IBDV感染细胞能力的影响 方1粗提物先于病毒加入，抑制程度呈抛物线形,抑制高峰浓度为0.048 8 mg ／ml(强抑制)，0.0061～0.0244 mg／ml呈中抑制,0.0031 mg／ml及0.0977～0.7813 m g／ml呈弱抑制;0.0015 mg/ml以下浓度未出现抑制作用。后加时未出现抑制效应。与病毒 同时加入时,在0.0031～0.0488 mg/ml浓度呈现强抑制,0.0015 mg/ml 和0.0977～0.78 13 mg/ml浓度呈中抑制,0.0008 mg/ml浓度呈弱抑制(见表1)。
2.2..方2粗提物对IBDV感染细胞能力的影响 .方2粗提物先于病毒加入，抑制程度亦呈抛物线形,抑制高峰浓度为0.3 906 mg／ml(强抑制)，0.7813～6.2500 mg／ml和0.1953 mg／ml呈中抑制,25.00 mg／ml、 12.50 mg／ml及0.0244～0.0977 mg／ml呈弱抑制。后加时未出现抑制效应。与病毒同时 加入时抑制程度与浓度呈正相关,25.00 mg／ml和12.50 mg／ml两个浓度表现为中抑制,0 .7813～6.25 mg／ml为弱抑制,0.3906 mg／ml以下浓度未见抑制作用(见表2)。
2.3 方3粗提物对IBDV感染细胞能力的影响方3粗提物先于病毒加入时，在0 0488 mg／ml浓度出现抑制高峰(强抑制),0.0977 mg／ml呈中抑制,0 .1953～0. 7813 mg／ml和0. 0244 mg／ml以下浓度呈弱抑制，后 加时未出现抑制效应，与病毒同时加入时,在0.0122 mg／ml以上呈强抑制,0. 0061 mg／ml 以下浓度呈中抑制 (见表3)。
表 1 方1 粗提物对IBDV感染细胞能力的影响(略)
表2 方2 粗提物对 IBDV 感染细胞能力的影响(略）
表3 方3 粗提物对 IBDV 感染细胞能力的影响（略）
3.1 实验结果表明,方1、方2和方3均有抑制病毒感 染效应，以方3效果最好。因此，可选方3为抗IBDV的主方,进行动物试验。
3.2 本实验发现,方剂抑制病毒感染细胞的 效应也与 单味中药粗提物相似，与细胞安全浓度有关。实验中方2的细胞安全浓度最高, 其抑制高峰浓度也相对较大，如粗提物先加时,方1和方3在0.0488 mg／ml呈现抑制高峰,方 2在0．3906 mg／ml呈现抑制高峰，抑制高峰浓度方2大于方1和方3各8倍;与病毒同时加时, 方1在0.0031～0.0488 mg/ml浓度呈现强抑制,方2在25.0000 mg/ml时抑制作用最强,方3 在0．0122 mg／ml以上呈强抑制，抑制高峰浓度方2分别高于方1 512～4 032倍和方3 32～ 1 024倍。然而,方剂的抗感染效应必须有适宜的浓度范围,在一定的浓度范围内,浓度越高抑制效应越强。超过适宜的浓度范围,浓度增高抑制效应反而减弱,如先加时,高于抑制高峰浓度, 抑制效应反而越减弱。这与黄芪等中药的促细胞生长作用有关。在细胞安全浓 度范围内，浓度越高,细胞生长越旺盛,但细胞的老化也越快,其对抗病毒感染的能力也随之 降低。同时,方剂的抗感染效应也与给药方式有关,如后加中药粗提物时未出现抗感染效应。关于方 剂的抗感染机理,可能也和单味中药的抗感染机理相同,是通过细胞抑制了病毒的繁殖。先加病毒后加中药时可能是病毒先入为主,中药已无能力消除感染。
3.3 实验中选用的三个方剂,方1具有补气、清热凉血作用,方2具有补气作用,方3具补气滋阴、清热解毒作用。先加时,方1在≤0 0015 mg/ml 时无抑制病毒效应，而方3在0 0008 mg/ml时仍能有效抑制病毒;与病毒同时加时,方2在≤0 3906 mg/ml无抑制病毒效应,而方1和方3在0 0008 mg/ml时仍能抑制病毒,之间相差488倍 。综合以上结果，方3在较低的浓度能抑制病毒增殖,效果最好;其次是方1,再次是方2,说 明补气滋阴、清热解毒类中药方剂更能抑制IBDV增殖。关于这一点，笔者已经在动物实 验上得到了验证（另文发表）。
