地胆头（Elephantopus scaber L.）又名土公英，属菊科地胆草属多年生草本植物，生于向阳山谷、林边、路旁、荒地等处的低草丛处,分布于我国南方各省，广东，广西和福建多见。它味苦微辛、性凉，药用全草，有清热解毒，凉血消肿等功效。自古以来民间用本药煎服能治疗炎症发热，用鲜品捣烂外敷可治疗蛇伤疥肿，煎水洗可治下肢溃疡，有拔毒止痱作用。根据历史记载，地胆草在我国的药用历史至少有500余年。近年研究表明，地胆头除具有消炎解热作用外，还具有明显的抗肿瘤作用及对白细胞有明显的抑制作用。其主要成分为羽扇豆醇、豆甾醇和倍半萜类化合物—地胆头内酯，其有效成分为地胆头内酯。本试验主要根据有效成分的化学特性获取和保留这些内酯类并兼顾黄酮类化合物，制备了地胆头注射液，并对药液进行了质量检查和安全性检查。
1 材料与方法
1.1 地胆头 于秋季采自广东省湛江市湖光岩东，经湛江海洋大学农学院植物分类学副教授吴钿鉴定。取全草，去杂，洗净，阴干，粉碎后保存于干燥阴凉处备用。
1.2 实验动物 大白兔6只（雌雄兼有，体重均为1.8 kg左右），昆明种小鼠15只（雌雄兼有，体重均为22 g左右）。均购自广东医学院实验动物中心。
1.3 试剂 分析纯无水乙醇（汕头市光华化学厂，批号20030704），分析纯乙醚（广州化学试剂厂， 20011202）， 葡萄糖（广州化学试剂厂，批号20000101-36），磺基水杨酸(广州化学试剂厂，200109012)，其他试剂均为国产分析纯。
1.4 注射液的制备
称取地胆头粉末3份，每份250 g，分别用适量的50%、65%、80%乙醇浸湿(依此编号为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ )，然后装入热回流装置，再分别加入以上浓度乙醇溶液，液面超出粉末面约5 cm（乙醇溶液用量约为1 000 ml），冷浸提12 h，再用60℃水浴加热回流4 h，分别将浸出液趁热过滤。收集过滤液，各加无水乙醇，使乙醇浓度达到80%（地胆头原液Ⅲ免去此步骤），调pH至8.0，以3 000 r/min离心5 min，将上清液60℃水浴加热蒸发乙醇和部分水，得到糖浆状的浓缩液。分别加适量的2%亚硫酸钠和2%碳酸氢钠进行溶解，再按1.5%～2%比例分别加入活性炭，搅拌，放置30～40 min，3 000 r/min离心10 min，将上清液过滤，用乙醚萃取2～3次，脱去油脂和脂溶性色素。60℃水浴加热挥去乙醚，4℃冷藏12 h。浓缩至稀释前1/2体积，调pH至6.8～7.0，得到浓缩液。在各个制备环节中，用氢氧化钠溶液和三氯化铁溶液检测黄酮，用热氢氧化钠溶液检测内酯类化物。按2.5%的比例分别给浓缩液加注射用葡萄糖，用注射用水稀释至适当体积，65℃水浴上搅拌，使充分溶解，过滤。按1.2%的比例分别加入活性炭，搅拌，放置30～40 min，过滤，定容至适当体积，流通蒸气灭菌30～40 min，无菌分装(每支2 ml)，即得地胆头注射液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。
1.5 质量检查
1.5.1 鞣质检查 取注射液1 ml，加稀醋酸1滴，再加明胶氯化钠试液（含明胶1%、氯化钠10%的水溶液，须新鲜配制）4～5滴，不得出现混浊。
1.5.2 蛋白质检查 取注射液1 ml，加新鲜配制的起人群发生某些疾病(如细菌性食物中毒等)。至于这种污染是发生于屠前抑或屠后，我们认为屠后固然可以发生，但不能排除屠前活体中已有细菌感染的可能性，因为镜检显示，细菌既然见于肝小叶内，也见于小叶间的血管之中，并且数量颇多，集聚有大量细菌的血管，有的其周围组织结构完好，管内外组织学上无连续性蔓延的病演。众所周知，动物死后血液循环已经停止，如果死亡后其肝脏受到细菌污染，除非伴有组织的连续性破坏、并波及血管，细菌是无法进入血行中的。此外，在被细菌污染的肝脏变性与坏死组织周围，出现了纤维组织增生，这更说明细菌是动物生前侵入的，否则不会产生这种修复性反应。
1.5.3 澄明度检查 30 W荧光灯下，以白色为背景，距20 cm处观察有无异物。
1.5.4 pH值 用酸度计测试。
1.6 安全性试验
1.6.1 刺激性试验 将6只健康家兔等分为3组，左眼分别滴加地胆头注射液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各2滴，右眼各滴加生理盐水2滴，每15 min观察1次，观察4次后，每小时观察1次，共观察6 h。
1.6.2 溶血性试验 2％红细胞混悬液的制备：取兔血5 ml，放于盛有玻璃珠的三角瓶中振摇10 min，除去纤维蛋白，使成脱纤血液，加约10倍量的生理盐水，摇匀，离心 除上清液，沉淀的红细胞要用生理盐水洗涤2～3次，至上清液不显红色为止。将所得的红细胞用生理盐水配成2％混悬液。
取试管6支，按表1分别加入地胆头注射液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，生理盐水和红细胞混悬液。其中，第6管为对照管。将各管轻轻摇匀，置于37℃恒温箱中，每15 min观察1次，1 h后每小时观察1次，一共观察4 h。如溶液变清并染红色，即表示溶血。必要时用显微镜观察红细胞是否破裂。如0.3 ml药液在0.5 h内引起溶血者即不宜作注射液使用。最好是药液0.3 ml在3 h内不引起溶血。如有红细胞凝聚现象，可按下方法进一步判定：将凝聚物在试管振摇后又能均匀分散，或将凝聚物放在载玻片上，在盖玻片边缘滴加2滴生理盐水，在显微镜下观察，凝聚红细胞能被冲散者为假凝聚，其制品可供临床使用。若凝聚不被摇散或在玻片上不被冲散者为真凝聚，其制品不宜供临床使用。
表1 地胆头注射液溶血性试验方法（略）
1.6.3 注射试验 将小鼠15只等分为3组，尾静脉注射地胆头注射液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各0.1 ml，在4～5 s匀速注射完毕，观察72 h。观察有否出现过敏反应及死亡。
2 结果
2.1 理化特性 地胆头注射液Ⅰ呈浅黄色，地胆头注射液Ⅱ呈桔黄色，地胆头注射液Ⅲ呈棕色。3种注射液均透明，稳定，无纤维、白块或色块出现。
2.2 澄明度检查 3种注射液均无异物，溶液澄明，透亮，鞣质和蛋白质检查中均未出现混浊和沉淀物。
2.3 刺激性试验
2.3.1 眼结膜刺激试验 分别用地胆头注射液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ给供试大白兔滴眼，3种注射液均未使供试大白兔眼结膜充血。
2.3.2 溶血性试验 试管内红细胞均沉降底部，上液清澈透亮，没出现溶血现象，将试管振摇后，可见混悬液能分布均匀，不出现凝血现象。
2.3.3 注射试验 小鼠注射后均精神良好，未见异常现象。
3 分析与讨论
3.1 本试验采用3种不同浓度的乙醇提取地胆头的有效成分—地胆头内酯，同时亦兼顾黄酮类成分。地胆头内酯和黄酮类物质均为脂溶性物质，采用乙醇提取，可增进有效成分的溶出，同时减少无效成分蛋白质等致热原的溶出。再将乙醇的浓度提高到80％，进一步使蛋白质沉淀，这就进一步去除了注射液的热原成分。另外中草药中的鞣质通过肌肉注射后可引起局部硬结和疼痛，静脉注射则可引起凝血，我们采用醇溶液调pH法，去除鞣质。经检验，3种注射液的蛋白质和鞣质的检查均符合要求。
3.2 植物的色素在乙醇回流抽提时溶出，植物色素分为水溶性色素和脂溶性色素，在地胆头注射液的制备中采用了乙醚萃取的方法脱色，但只能脱掉部分脂溶性的色素，大部分的水溶性色素难以去除，但不影响药液的澄明度。
3.3 本次实验在地胆头糖浆状浓缩液中加入亚硫酸钠，使脂溶性有效成分—地胆头内酯生成地胆头内酯的盐类，使有效成分成水溶性，从而增加了注射液有效成分的浓度。
3.4 在地胆头注射液的制备过程中，采用氢氧化钠溶液和三氯化铁溶液检测黄酮，用热氢氧化钠溶液检测内酯类化物，以监测和保证地胆头中的有效成分不丢失。经体外抑菌试验证明该注射液抑菌作用良好，说明该注射液具有相当含量的有效成分。
3.5 不管是肌肉注射还是静脉注射，注射液都要进入动物机体参与血液循环，这就要求注射液必须具有一定的渗透压。当注射液渗透压超过人体耐受范围时会产生刺激，而且会影响它的吸收，渗透压太低会造成溶血，因此，在注射液中以2.5%的比例加入了葡萄糖以调节渗透压。另外，中草药的皂甙也可造成溶血。经检验，所制备的地胆头注射液未使血细胞产生溶血，说明注射液未对血细胞的状态产生异常影响。
3.6 综合地胆头注射液的质量检查和安全性试验结果，证实所制备的地胆头注射液符合中草药注射的质量和安全性要求。但是在注射液的试制过程中采用多重滤纸过滤除去杂质，这可能增加了地胆头有效成分的丢失，故其制备方法和工艺尚有待进一步改进。
