维生素C对蛋鸡新城疫免疫性能的影响

摘要：本试验将60只体重相近的49日龄海兰贺蛋鸡随机分为A、B、C、D、E组，每组4个重复，每个重复3只。 B、C、D、E四组颈部皮下注射Ι系新城疫疫苗进行免疫，分别在B、C、D、E日粮中填加0㎎/㎏、200㎎/㎏、400㎎/㎏、800㎎/㎏的维生素C，分四周测血清中的HI效价及脾脏、胸腺、法氏囊等脏器指数。结果表明：添加维生素C可提高HI效价，对新城疫疫苗免疫效果有促进作用，其中400/㎏的维生素C效果较好；C、D、E组的脾脏、胸腺、法氏囊等脏器指数均高于B组，说明添加维生素C能促进脾脏、胸腺、法氏囊等免疫器官生长发育，进而影响细胞免疫和体液免疫性能。
关键词：维生素C；新诚疫；蛋鸡
　　维生素C是己糖的衍生物，具有酸性，因此也称L-抗坏血酸，家禽需要维生素C,鸡利用维生素C合成类固醇激素和氨基酸，进行矿物质代谢，维持免疫功能。饲料中含有一定量的维生素C，鸡的肝和肾也能合成维生素C，因此是否需要给鸡的饲料或饮水中添加维生素C，多少年来一直是一个有争议的问题，而且试验结果往往是相互矛盾的，目前尚未将维生素C列入鸡的饲养标准和鸡的必要维生素 。鸡自身虽然能合成维生素C，但在某些生长、生产阶段和高产品种条件下不能满足其生长和生产的需要，在鸡日粮中添加一定量的维生素C是有必要的。维生素C作为一种抗氧化剂，第一，自由基常常攻击生物膜的多链不饱和酸，引发一系列自由基连锁反应，使生物膜的结构和功能发生改变，但正常机体内的抗氧化防御系统在不同环节上阻断自由基反应。维生素C和自由基发生反应，减少自由基浓度从而避免细胞膜的破坏，维生素C保护免疫系统淋巴细胞，使得免疫细胞及时产生免疫反应，避免反应推迟，减少鸡的急性死亡； 第二，维生素C可限制机体在热应激时肾上腺类固醇的过量分泌，抑制环腺甘酸含量的增加，保护免疫功能，降低不良免疫反应，一种解释：热应激改变了内分泌机能的正常状态，使甲状腺功能异常，促甲状腺素分泌量改变，血浆中促肾上腺皮质激素显著增加，另有一种解释：热应激使甲状腺素利用受阻，使机体对甲状腺素的产生造成反馈抑制作用所致 。第三，维生素C 参与皮质激素-类固醇激素的合成，类固醇激素的功能是体内能量以维持生命功能，最主要的是维持体温 。维生素C是血液中最有用的抗氧化剂，是细胞外液抗氧化系统的第一道防线，对血浆中正在进行的脂质过氧化作用有阻断作用。维生素C作为自由基清除剂可以很快的与超氧阴离子自由基和过氧化氢反应，更快的与羟氧化基反应形成抗坏血酸自由基，他可以清除单线态氧，从而保护集体免受内源性氧自由基的损害 。
　　鸡新城疫(Newcastle Disease)是危害养鸡业的主要鸡病之一。新城疫（ND），又称亚洲鸡瘟，伪鸡瘟等，是一种急性、高度接触性传染病。典型新城疫特征为发病急，呼吸困难，头冠紫黑，下痢，泄殖腔出血、坏死，腺胃乳头、腺胃和肌胃交界处以及十二指肠出血，慢性病例常有呼吸道症状或神经症状。 国际兽疫局( OIE) 将其列为 A 类疫病, 我国其列为一类动物疫病。它在世界范围内出现了几次大流行, 造成了严重的经济损失。虽然鸡新城疫病毒仅有一个血清型, 但不同毒株生物学特性和毒力相差很大。世界各国对ND 的研究已有 60 多年的历史, 广泛使用各种疫苗进行免疫也有 30 多年的历史。我国1935年发现鸡新城疫, 现在全国范围内普遍存在, 并且是我国养鸡业危害最大、经济损失最重的禽病之一。虽然已投入了大量的人力、物力来研究鸡新城疫各方面的问题, 并采取了普遍预防接种和其他综合性防制措施, 取得了明显的经济效益, 已大大减少该病所造成损失, 但是鸡新城疫仍然是我国家禽的头号疫病( 在我们西部边疆民族地区更是如此)[7] 。
　　本试验一是为了验证维生素C是否能增强鸡新城疫免疫性能，探求添加多少维生素C，免疫效果较好。二是通过增加不同量的维生素C情况下测定新城疫抗体效价以及脾脏、胸腺、法氏囊等脏器指数的变化，进一步探讨维生素C对鸡免疫器官及对免疫应答的影响。本次实验主要目的在于研究 vc对蛋鸡新城疫抗体效价的影响，以便维生素C在蛋鸡饲养中的应用提供依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验动物及饲料：
60只49日龄海兰贺蛋鸡，购于太古县某鸡场,饲料由正大提供
1.1.2试验疫苗：
鸡新城疫Ι系苗，鸡新城疫Ⅳ系疫苗，由黑龙江省生物制品厂生产
1.1.3试验仪器：
50ul定量移液器，移液枪，离心机，高压锅，一次性注射器（2.5ml），PC管，96孔型微量反应板，电子天平
1.1.4试验所需药品：
3.5%柠檬酸钠溶液，0.9%NaCl氯化钠溶液，粉剂维生素C（华北制药）
1.2试验设计：
　　从49日龄海兰贺蛋鸡中挑选出重量接近的60只试验鸡，随机分成五组，每组4个重复，每个重复3只鸡。试验从56日龄开始至84日龄结束。五组分为A、B、C、D、E组，A组为对照组，B组为模型组， B组为注射疫苗+0㎎/㎏维生素C，C组为注射疫苗+200㎎/㎏维生素C，D组为注射疫苗+400㎎/㎏维生素C，E组为注射疫苗+800㎎/㎏维生素C。
1.3试验内容与方法：
1.3.1内容：
　　从49日龄喂基础日粮，与56日龄对B、C、D、E组颈部皮下注射新诚疫疫苗Ι系苗1ml，同时分别在其各组基础日梁中添加0㎎/㎏、200㎎/㎏、400㎎/㎏、800㎎/㎏的维生素C，自由饮水，每天喂3次。在注射后第7d（即63日龄），第14d（即70日龄），第21d（即77日龄），第28d（即84日龄）分别从A、B、C、D、E各组中随机抽取三只先称其重量，后心脏采血2ml，将注射器倾斜静置析出血清，分离血清装入PC管置-20℃冰箱冷冻备用。按常规方法致死，分离并测定脾脏、胸腺、法氏囊的重量，计算脏器指数[免疫器官指数=免疫器官湿重（㎎）/体重（㎏）]
1.3.2各种成分制备
1.3.2.1  四个血凝单位病毒抗原的制备：
　　可用新城疫Ⅳ系苗作抗原，测定其HA效价，据此配成四个血凝单位病毒抗原，然后装小瓶备用
1.3.2.2  1%红细胞悬液制备：
　　先用灭菌注射器吸取3.8%柠檬酸钠溶液（其量为所需血液量的1/5），取一只健康鸡，心脏采血到需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌生理盐水为抗凝血的2倍，以2000r/min离心10min，弃上清夜，把着附于红细胞间和上清夜间的白细胞去掉，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤3～5次，最后根据所需用量，用灭菌生理盐水配成1%悬液。
1.3.2.3  稀释液制备：
　　用固体NaCl和双蒸水配成0. 9%的生理盐水，高压灭菌后备用
1.3.2.4  抗凝剂：
　　用固体柠檬酸钠和双蒸水配成3.8%的柠檬酸钠100ml，高压灭菌后备用
1.3.3 鸡新城疫病毒的HA试验（β-微量法），如表1
1.3.3.1　用50 uL 定量移液器在1～ 12 孔内各加稀释液50ul。
1.3.3.2　用50 ul 定量移液器取病毒液50ul放入第1 孔内, 混匀, 而后从第1 孔内用50 uL 定量移液器取50ul放入第2 孔内, 混匀后取50ul放入第3 孔内, 如此类推直至第11 孔。第11 孔混匀后弃去50ul。第12 孔为对照孔, 不加病毒液。则病毒稀释倍数依次为1∶2～1∶2 048。
1.3.3.3　用50uL 定量移液器取1% 鸡红细胞悬液, 每孔各加50ul。
1.3.3.4　把反应板放在振荡器上振荡混匀约3～5m in, 再置18～22℃室温环境中, 60 min 后观察结果; 或置于37℃恒温箱内, 30 min 后观察结果。
1.3.3.5结果观察：
　　将微量反应板倾斜成30°～45°, 沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀, 表明红细胞未被或不完全被病毒凝集; 如果孔底的红细胞铺平孔底, 凝成均匀薄层, 倾斜后红细胞不流动,说明红细胞被病毒所凝集。
表1   血细胞凝集(HA)试验

注：#表示完全凝集，+表示不完全凝集，--表示不凝集
1.3.4 鸡新城疫病毒的HI试验（β-微量法），如表2
新城疫病毒凝集红细胞的作用能被特异性抗体所抑制, 因此可用HI 试验测定鸡血清中的HI 抗体效价。
1.3.4.1　用50 uL 定量移液器每孔各加50ul稀释液, 从第1 孔至第10 孔, 第11 孔为4单位病毒液50ul, 第12 孔为血清50ul作为对照。
1.3.4.2　用50 uL 定量移液器取血清50ul, 放入第1 孔, 混匀后移50ul至第2 孔, 第2 孔混匀后移50ul至第3 孔。如此连续稀释至第10 孔, 从第10 孔取50ul弃去。
1.3.4.3　用50 uL 定量移液器取四单位病毒液, 1～ 11 孔每孔各加50ul，第12孔加50ul血清,轻轻振荡，混匀置37℃温箱作用15～30min
1.3.4.4　用50 uL 定量移液器1% 鸡红细胞悬液, 每孔各加1 滴。
1.3.4.5　把微量反应板放在振荡器上振荡3～5 m in后, 置于37～38℃恒温箱内, 30m in 后观察结果。
1.3.4.6  结果：
将微量反应板倾斜成30°～45°, 沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀, 表明红细胞未被或不完全被病毒凝集; 如果孔底的红细胞铺平孔底, 凝成均匀薄层, 倾斜后红细胞不流动,

 表2   血细胞抑制凝集(HI)试验      单位:n㏒2

注：#表示完全凝集，+表示不完全凝集，--表示不凝集
2 结果： 
2.1 维生素C对蛋鸡HI的影响，见表3，图1
表3   添加不同量维生素C对血清中抗体HI效价的影响   单位:n㏒2

注：表中数据肩注大写字母不同表示差异极显著（P<0.01），小写字母不同表示差异显著(P<0.05),大小写字母相同或不标字母差异不显著(P<0.05).

图1  不同量Vc对HI的影响 
　　蛋鸡接种鸡新城疫疫苗后，HI逐渐升高。第3，4周达到高峰。从表中得出，B组与A组比四周内都差异显著（P<0.05）；第7d，C、D、E组与B组比差异显著（P<0.05）；第14、21中，C、E与B比差异显著（P<0.05）、D与B比差异极显著（P<0.01）；28d，C、E与B差异不显著(P>0.05)， D组与B组比差异极显著(P<0.01)。
2.2 维生素C对蛋鸡脾脏指数的影响，见表4

注：表中数据肩注大写字母不同表示差异极显著（P<0.01），小写字母不同表示差异显著(P<0.05),大
写字母相同或不标字母差异不显著(P<0.05).

图1  不同量Vc对脾脏指数的影响
　　随着鸡的成长，体重增加，脾脏逐渐增大，脾脏指数逐渐增加。B组与A组比四周内都差异显著（P<0.05）；第7，14，21d，C、E组与B组比差异显著（P<0.05），D与B比差异极显著（P<0.01）；28d，C、E与B差异不显著(P>0.05)， D组与B组比差异极显著(P<0.01)。
2.3 维生素C对蛋鸡胸腺指数的影响，见表5
表5  添加不同量维生素C对胸腺指数的影响   单位：mg/㎏

注：表中数据肩注大写字母不同表示差异极显著（P<0.01），小写字母不同表示差异显著(P<0.05),大
写字母相同或不标字母差异不显著(P<0.05).

图2  不同量Vc对胸腺指数的影响
　　随着鸡的成长,体重增加,胸腺先增加后减小，胸腺指数先增加后减小。B组与A组比四周内都差异显著（P<0.05）；第7d，C、D、E组与B组比差异极显著（P<0.01），第14、21中，C、E与B比差异显著（P<0.05）、D与B比差异极显著（P<0.01）；28d，C、D、E与B差异显著(P<0.05) 。
2.4 维生素C对蛋鸡法氏囊指数的影响，见表6
表6 添加不同量维生素C对法氏囊指数的影响   单位：mg/㎏

注：表中数据肩注大写字母不同表示差异极显著（P<0.01），小写字母不同表示差异显著(P<0.05),大
写字母相同或不标字母差异不显著(P<0.05).

图3  不同量Vc对法氏囊指数的影响
　　随着鸡的成长,体重增加,法氏囊先增加后减小，法氏囊指数先增加后减小。 B组与A组比差异显著（P<0.05）。第7d，C、D、E组与B组比异显著（P<0.05），第14、21、28d中D、E与B比差异显著(P<0.05)， D组与B组比差异极显著(P<0.01)； 14、21中，C、E与B比差异显著（P<0.05）、D与B比差异极显著（P<0.01）；第28d，C、E与B比差异不显著（P<0