鸡白血病诊断方法比较与研发新思路

　　鸡白血病诊断方法比较与研发新思路

　　刘会芳（石家庄市神九畜禽疾病防治及药物研究所）

　　刘兴林 陈桂清（河北省泊头市农业局 ）

　　鸡白血病特别是J亚型白血病（俗称血管瘤）在我国的快速传播，给养鸡业造成了极大的损害，对全国的鸡育种体系建设也形成了巨大的威胁。客观形势的发展使得广大种鸡场对白血病的诊断特别是快速诊断工作提出了很高很迫切的要求。今结合种鸡场的生产实际，就鸡白血病的有关诊断方法进行评述，并对白血病快速诊断产品研发提出一些新的思路，以供参考，以求引玉。

　　1 现在的诊断方法

　　现在鸡白血病的诊断方法主要有以下几种：一是病毒分离法；二是组织病理诊断法，目前已有很好的单克隆抗体免疫组化染色法；三是血清学诊断，目前主要的是ELISA（酶联免疫吸附试验）法；四是PCR（聚合酶链式反应）法。

　　1.1 病毒分离鉴定法

　　分离各亚型白血病病毒是很基础性的工作，也是确诊的重要手段。对于研究病毒的各种特性、机理和研发相关疫苗与药物等都具有很重要的意义。对于自国外引进种鸡的国家来说，一旦暴发白血病，其病毒的分离工作，对于追查病毒的来源具有特别重要的意义。

　　分离白血病病毒大体需要以下几个步骤：一是制备鸡胚成纤维细胞（CEF），有时为了排除内源性病毒的干扰，需制备对内源性病毒有抵抗作用的细胞或细胞系；二是病料的处理和接种；三是病毒的检测。

　　这种方法对诊断来说，结果最确切。不利之处，一是时间长，一般需要十几天甚至更长的时间；二是需专业设备、专业人员、专门试剂材料等；三是成本很高，成功率不太高。本方法单对诊断来说，并不是好的选择。一般实验室没有这个能力，绝大多数种鸡场也不具备应用能力。

　　1.2 组织病理诊断法

　　常用的方法是对HE（苏木精—伊红）染色切片进行显微观察。观察特征性的肿瘤细胞、肿瘤结节及细胞核与细胞浆变化。目前已大量使用的方法是，利用白血病病毒的特殊单克隆抗体使用细胞免疫组化染色法进行检测，这种方法可以直接确定各种组织中的肿瘤细胞病变与何种白血病病毒的关系，是一种很确切的方法。还有进一步利用组织芯片与免疫组化染色相结合来检测的方法。

　　还有一种方法就是间接荧光抗体法（IFA），就是用单抗或单因子血清和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗小鼠或抗鸡Ig抗体做间接荧光试验，在荧光显微镜下观察有关呈病毒特异性荧光的细胞。这也是一种结果较确切的方法。

　　这些方法需要专门的实验室、专门的设备器材及专业的人员，带有很强的科研性质，大多种鸡场无法做这些工作，而且对种鸡的（提前）净化来说有严重的滞后性（肿瘤早已形成），在种鸡场实际生产中利用价值不大。

　　1.3 血清学诊断

　　国外在上世纪60年代采用禽白血病补反检测方法，该方法敏感但操作复杂。我国八十年代开始采用检测羽髓的琼脂扩散试验（AGP），该方法适合大面积操作，在我国种鸡净化方面曾起到很大作用。利用白血病病毒有关基因重组产物作抗原也能很好地对白血病抗体进行检测。

　　目前进行应用最广泛的是ELISA（酶联免疫吸附试验）法。该方法既可做白血病各亚型的抗体检测，也可做病原检测。其使用大体过程包括样本准备、洗涤液准备、具体操作、结果判定（阳性阴性）等。ELISA商品化的产品多为白血病A、B、J亚型的抗体检测和群特异型的P27抗原检测。目前的科研发展已完全可以做出白血病各亚型的抗原检测的产品。

　　ELISA检测仍有一些未解的问题，如抗体检测中的雏鸡早期阳性率过高问题，有人认为是产品的适用性问题，也有的认为是内源性病毒部分表达所引起的干扰，目前尚有争论。另外就是检测抗原时所出现的内源性病毒的干扰问题，一是对产蛋种鸡可以用含内源性病毒较少的蛋清来检测，二是将来可以选用特殊的对白血病内源性病毒不发生反应的白血病病毒单克隆抗体来做产品检测原料，从而在检测中避开内源性病毒的干扰。

　　在种鸡场的实际生产中，一少部分大型种鸡场已开始进行白血病的ELISA检测，大多数种鸡企业未进行此项工作。所以上游的原种鸡场、祖代鸡场不进行相应的检测，一旦发生白血病，疾病就会沿育种体系链逐级放大、肆意流行，许多下游的父母代种鸡场和商品代养殖场损失就会甚为惨重。相关数据显示，如果不进行白血病检测和阳性种鸡淘汰工作，一个祖代场的白血病感染率是0.5%左右，其下游父母代种鸡场则为5﹪以上，再下游的商品代养殖场就会达到10%~40%。

　　造成我国育种体系中大多数上游种鸡场对白血病不加检测原因，一是相关试剂目前几乎全部来自国外，价格昂贵，一些种鸡场承担不起；二是此方法需专门场所、专门设备和专门的人员，需要不少的投入，检测时间也需几个小时，做大面积的检测所投入的人力成本也很高；三是一些企业本身对此病的检测重视不足。解决这些问题，一要支持和加快相关产品的国产化；二是国内研发者要适应产品的商品化要求和商业化模式，在科研产品的商品化和商业化操作问题上要特别注意产品的灵敏度、稳定性、有效期与持续性技术服务等问题；三是种鸡企业也要加强对相关疾病检测的重视。

　　当然，对于种禽白血病感染过多（如超过40%）的种禽场，也可以借鉴国外的经验，提取本场白血病病毒做灭活苗进行防疫，同时严格进行病毒检测，将带毒种禽严格淘汰。这样做的不利之处，是其检测的代次要多一些。

　　1.4 PCR（聚合酶链式反应）法

　　PCR法是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。在白血病各亚型病毒的特定基因（gp37、gp85、P27、P12等）和全部基因的分析等方面具有基础性意义。对研究病毒的演化、进化和病毒的诊断具有重大意义。其基本过程是由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增，然后进行电泳检测。利用PCR的检测方式有多种，如荧光PCR、RT—PCR等。

　　PCR灵敏度高，能够检测到来自肿瘤组织、病毒感染的其他组织和细胞培养物中微量的白血病前病毒DNA，通过反转录PCR(RT—PCR)还可以检测白血病病毒RNA。对于内源性病毒的干扰，可以选取特定的基因片段（如pol）做引物来避免。

　　目前PCR法是相关科研单位常用方法，个别种鸡场也开始使用这种方法。由于这些方法需要专门的试验室、专业设备和专业人员，成本较高且无法做现场检测。这种方法也不适合种鸡场的大面积使用，一般种鸡场也没有能力做这些工作。

　　1.5小结

　　对一般种鸡场来说，没有能力去做病毒分离和组织病理诊断，PCR法因要求较高也不易开展，只有ELISA方法在很小范围得到应用。还有一个原因就是相关设备和试剂价格高，企业承担不起也不愿接受，如ELISA法检测一只种鸡的一项指标，市场要价在40元左右，如果一个种鸡场养5万套种鸡，做全面检测就需要至少200万元，显然种鸡场无法接受，也承担不起。目前种鸡场对检测产品的要求有以下几点：一是产品灵敏度高、稳定性好；二是价格低廉，一头份费用在几元以内；三是检测快速，最好在几分钟内完成；四是能现场操作，且操作步骤简单。

　　实际上，有一类科研产品能够满足这些要求。那就是白血病胶体金快速诊断产品。这类产品在将来有可能成为一种应用广泛的检测手段。

　　2 白血病胶体金快速诊断试纸

　　胶体金试纸是利用抗体、抗原胶体金标记技术和免疫层析技术进行抗原或抗体结合形成夹心免疫复合物并显色的技术。此类产品在禽流感、新城疫、法氏囊等疾病的诊断上已有很好的应用。由于金标技术是很成熟的技术，而白血病病毒的单克隆抗体和重组基因产物也有了很好的产品，所以白血病胶体金快速诊断试纸研发已具备很好的前提。因试纸产品具有灵敏度高、稳定性好、操作简便可现场操作、诊断快速、价格低廉且不需其他专业设备等特点，更容易为种鸡场大面积使用。所以大有研发的必要。今就有关思路进行简介，以供感兴趣的科研工作者参考。

　　2.1白血病试纸研发的具体思路

　　目前制作多种亚型病毒的检测试纸和通用试纸的条件都已具备，但据目前白血病流行特点来说，以下试纸应在研发上应优先考虑：

　　试纸一：普通型白血病抗原胶体金快速诊断试纸

　　检测线选用P27衣壳蛋白的一株单抗， P27衣壳蛋白的另外一株单抗或多抗与胶体金相结合（标记），质控线则选相应的二抗。这样的试纸可以检测所有的白血病病毒。

　　试纸二：J亚型白血病抗原胶体金快速诊断试纸

　　检测线选用J亚型病毒gp85表面蛋白的一株单抗，另外一株J亚型病毒gp85表面蛋白的单抗或多抗与胶体金结合，质控线则选相应的二抗。这样的试纸可以检测样本中是否有J亚型白血病病毒或检测到的白血病病毒是否是J亚型的。

　　试纸三：普通型的白血病抗体胶体金快速诊断试纸

　　检测线选用基因重组表达的P27衣壳蛋白，另一基因重组表达的P27衣壳蛋白与胶体金相结合，质控线则选择相应的抗体或单抗，亦可实验选用SPA。

　　这三个试纸恰当选用，既可检测白血病病毒，又可检测白血病抗体，还可以确定白血病病毒是否为J亚型的。基本能够满足种鸡场的检测要求。

　　2.2关于白血病胶体金试纸的检测质量提高的相关技术问题

　　目前常有的胶体金是中等颗粒的“红金”。以此为基础的产品，在检测过程中常出现“红雾”，从而影响检测线的结果观测。在研发出“红金”试纸后，如果有关科研人员想进一步提高试纸的检测质量，可以考虑应用目前国外个别公司开始使用的大颗粒“紫金”技术。以“紫金”为基础的试纸在检测过程中不出现“红雾”，从而能够大大提高观测的质量。

　　只是在研发过程中要注意以下两点：一是以“红金”为基础的数据到“紫金”处，不一定适用，要做一部分修改；二是“红金”下的稳定性与“紫金”下的稳定性不同，这里的稳定性有两个方面要考虑，一是抗体或抗原与胶体金的结合，另一个是产品的有效期的问题。