鸡心包积液综合征（安卡拉病）病原分离检测

　　禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAV)是一种无囊膜的双链DNA病毒，衣壳呈规则的20面体结构，直径约80-110nm，可分为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ三群，其中Ⅰ群FAV有12个血清型(FAV1～12)，Ⅰ群FAV具有共同的群抗原，比较著名的病毒株有鸡胚致死孤儿病毒(CELO virus)，鹤鹑支气管炎病毒，鸡包涵体肝炎病毒等，其中Ⅰ群FAV中C种FAV-4型认为是引起鸡心包积液综合征的病原。本病对3-6周龄肉仔鸡易感，潜伏期短、发病快。感染鸡群突然出现大批死亡，剖检发现心包积水、肝细胞有嗜碱性核内包涵体，以及用透射电镜在感染的肝细胞核内观察到有腺病毒颗粒。本实验采取病死鸡肝，心，肾脏进行病理组织学观察，可见形状不规则的嗜酸性或嗜碱性包涵体。同时取疑似鸡心包积液综合征病死鸡的肝组织粗提DNA，设计引物对DNA进行PCR扩增和基因测序分析，同时最后接种雏鸡，雏鸡一周后出现死亡，用相同方法获取组织DNA后进行PCR检测，可发现相同条带，表明成功建立鸡心包积液综合征(安卡拉病)病原分离检测方法。

 

　　1、流行病学

 

　　本病主要开始发生于1-3周龄的肉鸡、817、麻鸡，也可见于肉种鸡和蛋鸡，其中以3-7周龄的鸡发病较多。因首次发现于巴基斯坦卡拉奇靠近安卡拉的地方，故又名安卡拉病(Angrara disease)。发病鸡群多于3周龄开始死亡，4-5周龄达高峰，高峰持续期4-8天，5-6周龄死亡减少。病程8-15天，死亡率达20%-80%，一般在30%左右。发病鸡无明显先兆而突然倒地，沉郁，羽毛成束，出现呼吸道症状，甩鼻、呼吸加快，排黄色稀粪，有神经症状，两腿划空。本病主要垂直传播，也可水平传播。鸡感染后可成为终身带毒者，并可间歇性排毒。就腺病毒来说，已呈全国流行，但就表现出本病症来说，现在在山东、河南、安徽、辽宁、吉林、河北、江苏均有报道，其传播速度和传播面还是较大的。

 

　　2、解剖及病理组织检测

 

　　如图心脏部位形成淡黄色透明的心包积液，且肝脏有病理坏死现象。

　　采集发病活鸡肝心肾组织器官，经4%甲醛固定后制作石蜡切片，观察病理组织学变化，主要病理组织学变化表现在肝脏，可见肝脏充血、出血和肝细胞脂肪变性，肝细胞核内可见形状不规则的嗜酸性或嗜碱性包涵体。

疑心包积液病死鸡肝组织HE染色镜检

肾组织HE染色

心组织HE染色

　　3、病原PCR检测

 

　　3.1　引物设计与合成

 

　　根据Genbank中Ⅰ群禽腺病毒FAV-4型(AY581297.1)六邻体基因序列，应用Premier5.0设计FAV-4型引物(由上海生工公司合成)。

 

 

　　3.2　病原DNA的提取及PCR扩增

 

　　准备2个灭菌1.5mlEP管，每管按1：1加肝组织匀浆与灭菌ddH2O，8000r离心4分钟收集上清液，按1：1加入分析纯氯仿静置10分钟后8000r离心5分钟，吸取上清液直接PCR，采用25ulPCR体系：

 

　　DNA样本　　　　　　　　　1ul

　　10*PCR Buffer(Mg2+add)　2.5ul

　　dNTP(2.5umol/L)　　　　2ul

　　引物F/R各　　　　　　　0.5ul

　　Taq酶(5U/ul)　　　　　　0.5ul

　　灭菌ddH2O　　　　　　　　18ul

 

　　Buffer，dNTP，Taq酶均购自全式金，94℃　5min；94℃　45s变性；57℃　45s；72℃　45s，35个循环扩增；72℃延伸10min，4℃保存。反应结束后取全部PCR产物25ul，Trans 2000DNA marker对照，0.8%琼脂糖凝胶电泳，观察扩增片段大小。

FAV-4引物PCR扩增组织提取DNA

　　3.3 PCR产物序列测定

 

　　25ul体系PCR后0.8%琼脂糖凝胶中空胶电泳，将目的条带切胶回收后与pMD18-T载体(购自Takara公司)进行连接，连接体系：

 

　　目的条带　　　5ul

　　solutionⅠ　　4.2ul

　　T载体　　　　0.8ul

 

　　16℃于PCR仪中连接30min，然后将连接产物10ul转化进50ul的Trans1-T1感受态细胞(购自Trans)，冰浴30min后热激90s，紧接冷敷3min，加800ulLB震荡培养1h后6000r离心1min沉淀菌体，留100ul菌液涂布于Amp抗性的平板中37℃培养10小时，挑取单菌落接种于Amp抗性的5ml LB液体试管培养基后37℃震荡培养过夜(220rpm/min)，然后将菌液送生工公司测序，测序结果应用DNA star软件MegAlign的Clustal W方法与FAV-4基因进行序列比对，在送测序列中发现和295bp扩增目的片段一致的序列，表明于病鸡肝脏成功检测到FAV-4型腺病毒。

 

　　3.4病原接种试验

 

　　将病理肝组织与灭菌生理盐水匀浆搅匀后给雏鸡口服0.5ml匀浆液，此后于37℃恒温饲养，雏鸡一周后出现死亡，取死亡鸡肝脏组织用以上相同方法获取组织DNA后进行PCR检测，可发现相同条带。